산화환원 보조인자 재생 조작을 통한 성장 결합 효소 공학

현재 바이오테크놀로지 수단을 통해 재생 가능 원료로부터 점점 더 다양한 화학물질이 생산되고 있습니다. 바이오프로세스는 이러한 화합물의 효율적 생산을 위해 효소 촉매에 크게 의존합니다. 따라서 효소가 필요한 환경에서 최적의 성능을 발휘하도록 보장하는 것은 지속 가능한 생산에 매우 중요한 과제입니다.

기질 특이성, 촉매율, (열)안정성과 같은 특성은 효율적인 효소 기반 생체 공정을 위해 최적화되어야 할 여러 중요한 요소 중 하나입니다. 이 최적화는 시간과 비용이 많이 들며 도전적일 수 있으므로, 효과적이고 비용 효율적인 성장 결합 선택법으로, 바람직한 특성을 가진 공학 효소가 매우 선호됩니다.

효소의 활성을 세포 성장에 연결하는 효소 선택의 한 형태로 성장 결합 선택을 사용하는 장점. 이 방법은 고처리량 선택 전략으로 사용할 수 있으며, 성장이 표적 효소의 생성물 합성에 의존하도록 하거나 효소의 활성을 세포의 전역 에너지 상태와 연계함으로써 달성할 수 있습니다. 합성생물학은 성장 결합 선택에 적합한 균주를 설계하는 데 활용될 수 있으며, 최근에는 산화 또는 환원 상태의 산화 또는 환원 상태가 부족한 효소 공학 플랫폼 역할을 할 수 있는 변종 설계에 중점을 두고 있습니다. 이러한 플랫폼의 사용은 향상된 생체 촉매와 생체 공정의 개발을 가속화할 수 있습니다.

보조 인자 조성장을 통한 성장 결합의 이점

지질, 바이오연료, 기체, 유기 용매, 고분자 화합물과 같은 특정 화학물질의 생합성에 관여하는 효소를 설계하는 데 보조 인자 조약자 합성 방법을 선택하는 방법으로서 사용하는 이점. 이 방법은 기질이나 관심 있는 생성물과 독립적으로 원하는 제품을 선택할 수 있다는 점, 향상된 효소 활성의 탐지, 효소 활성 개선을 위한 판독 기능 등 여러 독특한 이점을 제공합니다. 또한, 성장 결합 플랫폼으로서 보조인자 조형성자를 사용하는 것은 미생물 대사에서 산화환원 보조인자의 보편적 특성 덕분에 연구 전략을 다른 관심 미생물에 수평적으로 전이할 수 있고, 원하는 미생물 숙주 환경 내에서 효소를 직접 조작할 수 있기 때문에 유익합니다. (그림 1에 나타남)

그림 1: 효소 공학을 위한 여러 널리 사용되는 스크리닝/선택 기법 비교

NADH 산화 결핍 돌연변이체

대장균에서 NADH의 산화는 산소 가용성에 따라 두 가지 경로를 통해 일어날 수 있습니다. 호기성 조건에서는 주로 호흡을 통해 산화되어 ATP를 생성하며, 혐기성 조건에서는 발효 경로를 통해 산화되어 락테이트와 에탄올을 생성할 수 있습니다. 혐기성 성장 중 NADH 산화를 위한 혼합 발효 경로를 사용할 수 없는 대장균 돌연변이 균주들은 2-메틸프로판-1-올, 2,3-부타네디올, 1-부탄올, L-알라닌 등 다양한 화학물질의 혐기성 합성을 위한 NADH 산화 경로를 유도하는 데 사용되었습니다. 이 돌연변이 균주들은 유사한 산화환원 원리를 이용해 효소를 설계하는 데에도 사용되어 개선된 변이체를 만들어냈습니다. 결과된 균주는 다른 NAD(P)H 의존성 효소와 경로를 유치하는 데 사용될 수 있습니다.

NAD+ 환원이 결핍된 돌연변이  

Wenk 등은 디하이드로리포일 탈수소효소(LPD) 유전자를 삭제하여 대장균을 만들었는데, 이로 인해 피루브산 탈수소효소 활성이 없어 아세테이트 대사로부터 환원력(NADH 및 NADPH)을 생성할 수 없게 되었습니다. 이로 인해 이 균주는 아세테이트를 유일한 탄소원으로 유기적으로 성장시킬 때 힘을 감소시키는 보조 영양 효과를 보였다. (그림 2에 나타남) 이 균주는 상부 당분해 기질을 보충하거나 NAD+ 의존성 포마트, 에탄올 또는 메탄올 탈수소효소를 각각 기질과 함께 발현할 때 아세테이트 위에서 성장할 수 있었습니다. 이 균주는 효소 공학에 사용되지 않았으며, 산화환원 보조인자 증조성장만을 평가했습니다.
 

그림 2: 중추 대사 

NADPH 산화 결핍 돌연변이체

대장균에서 NADP+ 자비형성을 유도하는 두 가지 전략이 있으며, 이는 당분해 경로를 조작해 NADPH를 과다 생산하는 것입니다. 첫 번째 전략은 천연 gapA 유전자를 삭제하고 이종성 NADP+ 의존성 GAPDH 효소를 발현하는 것이고, 두 번째 전략은 탄소 흐름을 펜토스 인산염 경로를 통해 재유도하는 것입니다. 결과적으로 생성된 균주는 포도당에서는 성장하지 못하지만, 첫 번째 균주는 혐기성 조건에서, 두 번째 균주는 글리세롤을 기질로 하는 호기성 조건에서 성장합니다. 이 균주들은 기질 특이성, 촉매 활성, 열안정성 등 향상된 특성을 가진 효소를 설계하는 데 사용됩니다.

NADP+ 환원이 결핍된 돌연변이체

세 가지 다른 박테리아인 대장균, P. putida, C. glutamicum은 NADPH-보조영양성으로 유전자 조작되어 성장을 위해 외인성 NADPH가 필요함을 의미합니다. 대장균과 글루타미쿰 씨앗의 경우, 포도당이 탄소원으로 제공될 때 NADP+ 감소를 피하기 위해 중심 대사 효소가 제거되었으나, P. putida에서는 CRISPR/nCas9 보조 공학을 이용해 표적 유전자 집합을 순차적으로 교란하여 산화환원 대사에 관여하는지 이해하였습니다. 이후 NADPH-조소영양 균주는 보조 인자 특이성을 기반으로 한 성장 결합 효소 공학에 사용되었습니다. 대장균을 이용한 단일 돌연변이 유발 과정에서 지금까지 가장 효율적이고 특이적인 NADP+ 의존성 포마테 탈수소효소가 나왔으며, P. putida와 C. glutamicum은 이러한 공학에 사용할 수 있는 최초의 균주를 대표한다.

NMN+ 환원에 결핍된 돌연변이체

NMN+ 감소 결핍을 기반으로 보조인자 순환과 성장을 연결하는 성장 결합 선택 시스템이 개발되었습니다. 이 균주인 대장균 SHuffle이 사용되었으며, 이 균주는 환원된 글루타티온 생성에 관여하는 두 유전자의 결실을 가지고 있습니다. 합리적 돌연변이 유발을 통해 NMN+/NMNH 순환과 연관된 NMNH 의존성 글루타티온 환원효소가 개발되었고, NMN+/NMNH 보조 인자 순환과 성장을 지원하는 NMN+/NMNH 의존성 포도당 탈수소효소가 사용되었습니다. 또한 연구는 비정규 산화환원 보조인자 증조성장을 성장 결합 효소 공학에 처음으로 적용하여, 시험관 내에서 촉매 효율과 시간 안정성이 향상된 열안정성 인산 탈수소효소 변이체를 개발했습니다. 이 연구는 비정통 산화환원 보인자의 환원 상태에 대해 NMN+/NMNH 순환에 의존하고 조성장성(auxotrophopic)을 수행하는 성장 결합 효소 공학에 유용한 계통을 제공합니다.

산화환원 보조인자를 통한 성장-결합의 잠재력은 특히 지속 가능한 생물생산 맥락에서 생물촉매를 설계하는 강력한 도구로 작용했습니다. 산화환원 보조인자 위영양 균주 생성에 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 이 성명은 아직 탐구되지 않은 연구 분야가 여러 남아 있음을 시사합니다. 그 중 하나는 대장균 이외의 조형성 생물 보조 인자 변종을 공학적으로 만드는 것으로, 성장 결합 효소 공학의 새로운 가능성을 열어줄 수 있습니다.

전반적으로, 산화환원 보동인자 기반 성장-결합의 사용은 특히 다른 고처리량 효소 공학 접근법의 요구를 충족하지 못하는 제품 생산에 있어 생촉매 공학에 큰 기회를 제공한다는 점을 시사합니다. 지속 가능한 생물생산을 위한 보다 다재다능하고 효율적인 생물촉매 개발의 필요성을 강조하며, 이 분야에서 지속적인 연구의 중요성을 강조합니다.


참고문헌: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, 산화환원 보조인자 재생 조작을 통한 성장 결합 효소 공학, Biotechnology Advances, 2023.