생쥐 좌골 신경에서 NAD+ 및 그 대사산물의 정량
소개
노화와 신경퇴행에서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 그 대사산물의 핵심적인 역할은 널리 인정받고 있습니다. 노화 및 신경퇴행성 질환을 표적으로 하는 생화학적 연구와 중재법의 발전을 촉진하기 위해서는 NAD+ 회수 경로에서 NAD+ 및 그 대사산물 수준을 정확하게 정량하는 것이 매우 중요합니다. 본 연구에서는 정상 및 손상된 마우스 좌골신경에서 NAD+ 및 그 대사산물의 수준을 정량하기 위해 강력하고 정확한 LC-MS/MS 방법을 적용했습니다.NAD+ 및 그 대사산물 정량을 위한 기존 방법의 한계
HPLC-UV, NMR, 모세관 구역 전기영동 또는 비색 효소 분석과 같은 NAD+ 및 그 대사산물을 정량하는 기존의 방법들은 감도, 선택성 및 간접 측정에 있어 다양한 어려움에 직면합니다. 세포 또는 조직 내 NAD+ 및 그 대사산물 측정을 위한 기존의 LC-MS/MS 분석법의 경우에도 긴 실행 시간, 불량한 크로마토그래피 머무름 거동, 만족스럽지 못한 피크 모양 등 해결해야 할 많은 어려움이 여전히 있습니다. 게다가 이러한 방법들로는 NAD+ 회수 경로의 물질 중 1~3개만을 다룰 수 있습니다.LC-MS/MS 방법의 수정
기존 LC-MS/MS 분석법을 기반으로 크로마토그래피 조건, 대체 매트릭스 및 MS/MS 조건에 관한 수정이 수행되었습니다. 구체적으로, 5 μM의 메틸렌 포스폰산이 이동상 첨가제로 사용되어 신호 강도와 피크 모양을 명확히 개선합니다. 신경 샘플의 비교적 깨끗하고 단순한 특성과 작은 크기를 고려하여, 초순수가 대체 매트릭스로 테스트되었습니다. 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 컬럼과 하이퍼카브 컬럼 대신 Waters Atlantis Premier BEH C18 AX 컬럼이 사용되었으며, 이 컬럼의 독특한 MaxPeak HPS 고성능 표면 기술(컬럼 내벽을 부동태화하여 금속 표면을 제거)은 모든 분석물의 높은 재현성, 피크 대칭성 및 베이스라인 분리를 가능하게 합니다.또한, MS 조건은 cADPR 및 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)의 응답을 유지하면서 고리형 아데노신 이인산 리보스(cADPR) 채널에서 NAD+ 간섭 신호를 최소화하도록 최적화되었으며, 이온 스프레이 전압 4000V, 터보 히터 온도 450℃, 가스 1 50 psi, 가스 2 50 psi, 커튼 가스 30 psi, 충돌 가스 12 psi로 설정되었습니다.
신경 샘플의 대표적인 크로마토그램(정상 vs 손상)
다섯 가지 분석물 모두 베이스라인 분리를 달성했으며, cADPR는 신경퇴행 모델에서 민감한 바이오마커입니다. 본 연구에서 좌골신경 축삭 절단은 축삭 변성을 유도하여 손상된 신경에서 NAD+ 수준을 감소시키고 NMN 수준을 상승시켜 NMN/NAD+ 비율이 약 2배 증가했습니다. 동시에 니코틴아미드(NAM)와 아데노신 이인산 리보스(ADPR)의 수준은 약 2배 감소한 반면, cADPR 수준은 8배 이상 증가했습니다. 이러한 결과는 이전에 보고된 연구 결과와 일치하여, NAD+ 및 그 대사산물을 정량하는 이 수정된 LC-MS/MS 방법의 정확성을 검증합니다.
결론
이 수정된 LC-MS/MS 방법은 5분의 짧은 실행 시간 내에 NAD+, NMN, NAM, ADPR 및 cADPR의 효과적인 베이스라인 분리를 가능하게 하며, 이는 다양한 신경계 질환의 조기 진단과 노화 및 신경퇴행성 질환을 위한 약물 개발에 기여합니다.참고문헌
Ma Y, Deng L, Du Z. Development and validation of an LC-MS/MS method for quantifying NAD+ and related metabolites in mice sciatic nerves and its application to a nerve injury animal model. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC은 2012년부터 조효소 및 천연물 원료의 연구개발, 제조 및 판매에 전념해 왔으며, 자체 공장, 170개 이상의 글로벌 특허 및 강력한 R&D 팀을 보유하고 있습니다. BONTAC은NAD 및 그 전구체(예: NMN 및 NR). 선택할 수 있는 다양한 유형의 NAD가 있으며, NAD ER 등급(엔독신 제거), NAD I 등급(IVD/건강기능식품/화장품 원료 분말), NAD II 등급(원료 의약품/중간체) 및 NAD IV 등급(용해도에 대한 더 높은 요구사항이 있는 경우)을 포함하며, 동결건조 분말 또는 결정성 분말 형태로 제공될 수 있습니다. BONTAC NAD의 순도는 98% 이상에 도달할 수 있습니다.
