마우스 좌골신경에서 NAD+ 및 그 대사산물의 정량화
소개
니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+)와 그 대사산물의 노화 및 신경퇴행 과정에서 중요한 성분들은 널리 인식되고 있습니다. 노화 및 신경퇴행성 질환을 겨냥한 생화학적 연구와 개입의 진전을 촉진하기 위해, NAD+ 구조 경로에서 NAD+와 그 대사물 수준을 정확히 정량화하는 것이 매우 중요합니다. 여기서는 정상 및 손상된 마우스 좌골신경에서 NAD+와 그 대사물 수준을 정량화하기 위해 견고하고 정확한 LC-MS/MS 방법을 적용합니다.NAD+ 및 그 대사산물을 정량하는 기존 방법의 한계
HPLC-UV, NMR, 모세관 영역 전기영동, 색도 효소 분석법과 같은 NAD+ 및 그 대사산물을 정량하는 전통적인 방법들은 감도, 선택성, 간접 측정 측면에서 다양한 도전에 직면해 있습니다. 기존의 세포 또는 조직 NAD+ 및 대사산물 측정에 대한 LC-MS/MS 분석은 여전히 연장된 실행 시간, 크로마토그래피 보존 능력 저하, 불만족스러운 피크 형태 등 많은 어려움을 극복해야 합니다. 더불어, NAD+ 회수 경로 내 물질은 한세 가지만 이 방법으로 포함할 수 있습니다.LC-MS/MS 방법의 수정
기존의 LC-MS/MS 분석법을 바탕으로 크로마토그래피 조건, 대체 매트릭스 및 MS/MS 조건에 대한 수정이 수행됩니다. 구체적으로, 5 μM 크기의 메틸렌 포스폰산 첨가제가 이동상 첨가제로 사용되어 신호 강도와 피크 형태를 명시적으로 촉진합니다. 네버 샘플은 비교적 깨끗하고 단순하며 크기도 작기 때문에, 초순수수는 대체 매트릭스로 시험됩니다. 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 컬럼과 하이퍼카브컬럼 대신, Waters Atlantis Premier BEH C18 AX 컬럼이 사용되었으며, 이 컬럼의 독특한 MaxPeak HPS 고성능 표면 기술(컬럼 내벽 패시시브 처리, 금속 표면 제거)은 모든 분석물의 높은 재현성, 최대 대칭성, 기준선 분리를 가능하게 합니다. 또한, MS 조건은 고리형 아데노신 이인산염 리보스(cADPR) 채널의 NAD+ 간섭 신호를 최소화하면서도 cADPR과 니코티나마이드 모노클레오타이드(NMN)의 반응을 유지하도록 최적화되어 있습니다. 이온 분사 전압은 4000V, 터보 히터 온도는 450°C, 가스 1은 50 psi, 가스 2는 50 psi, 커튼 가스는 30 psi, 충돌 가스는 12 psi입니다.
신경 샘플의 대표적 크로마토그램(정상 vs 손상)
다섯 가지 분석 대상 모두 기초 분리를 달성하며, cADPR은 신경퇴행 모델에서 민감한 바이오마커입니다. 여기서 좌골신경 축삭 절개술은 축삭 퇴행을 유도하여 손상된 신경의 NAD+ 수치가 감소하고 NMN 수치가 상승하여 NMN/NAD+ 비율이 약 2배 증가합니다. 동시에 니코틴아마이드(NAM)와 아데노신 디포스페이트 리보스(ADPR) 수치는 약 2배 감소하는 반면, cADPR 수치는 8배 이상 증가합니다. 이 결과는 이전에 보고된 연구들과 일치하며, 이 수정된 LS-MS/MS 방법이 NAD+ 및 그 대사산물을 정량하는 데 있어 정확성을 검증합니다.
결론
이 수정된 LC-MS/MS 방법은 NAD+, NMN, NAM, ADPR, CADPR을 5분이라는 짧은 시간 내에 효과적으로 기초선 분리할 수 있게 하여 다양한 신경학적 질환의 조기 진단과 노화 및 신경퇴행성 질환에 대한 약물 개발에 기여합니다.참고문헌
마 Y, 덩 L, 두지. 쥐 좌골신경에서 NAD+ 및 관련 대사산물을 정량하는 LC-MS/MS 방법 개발 및 검증 및 신경손상 동물 모델에 적용. J 크로마토그르 A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821본탁 나드
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